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단색광이 어떤 물질용액을 통과할 때, 투과광의 강도(I)와 입사광의 강 도(I0)와의 비를 투과도(T)라 하고, 투과도의 역수의 상용대수를 흡광 도(A)라 한다. 흡광도(A)는 용액의 농도(c) 및 액층의 길이(l)에 비례한다.
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어떤 요인이 흡광도에 영향을 줍니까? – eCuvettes
흡광도(A)는 광학 밀도(OD)라고도 하며 요소가 흡수하는 빛의 양입니다. … 연구원은 재료보다는 용액의 흡광도에 관심을 가지고 있기 때문에 최대 …
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Date Published: 10/1/2022
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흡광(Absorbance) – Molecular Devices
Optical Density(OD) 라고도 알려져 있는 흡광도(Absorbance)는 용액에 의해 흡수 … 이는 일반적으로 선형성에 영향을 미치며, 2.0~2.5 이상의 OD를 측정하는 경우에 …
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하루에도 몇 번씩 하는 흡광도 측정! 제대로 알고 하자! > 단백질 …
흡광도 측정에 사용되는 두번째 원리는 ‘모든 물질은 고유의 흡광 파장을 가진다’는 것이다. 예를들어 아래 그림은 순수한 물의 흡수 스펙트럼이다. (이미지 …
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Date Published: 6/11/2021
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왜 흡광도가 1이 넘으면 안되는걸까? – Chemiolin
물론 UV 쪽 파장을 쬐어서 흡광도도 측정할 수 있기 때문에, 형광을 발하는 시료 … 발색단, 즉 빛을 흡수하는 분자들은 서로 다른 분자들에 영향을 …
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Date Published: 5/25/2021
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고등학생을 위한 분광광도법 : (1) 기초
따라서 쬐어주는 빛의 파장에 따라 분자에 미치는 영향이 다르다. … 분광 광도계로 흡광도를 측정할 때, 분석할 물질(시료)을 셀(cell) 또는 …
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UV-Visible Spectrophotometer (자외 및 가시선 분광분석법)
어떤 시료 분자가 어느 파장의 빛을 흡수하며, 그 흡광도는 얼 … 균 거리가 짧아지므로 서로의 전자 분포상태에 영향을. 주게 된다. 화학종 간의 상호 작용도 농도에 …
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흡광광도법(UV/Vis)을 이용한 미생물의 증식 측정 – 네이버 블로그
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Chapter 14. Applications of Ultraviolet-Visible Molecular …
[봉우리 파장에 미치는 용매의 효과] … 흡수 화학종의 비공유 전자쌍과 수소결합을. 하기 때문 … 흡광도가 영향을 받지 않는 분석 조건을 선택.Source: contents.kocw.or.kr
Date Published: 5/23/2021
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분석학
검액에 목적 성분 분석에 영향을 주는 시액이 없을 경우 흡광도- … 자신은 빛을 흡수하지 못하지만 이웃하는 발색단의 흡수파장 또는 흡광도에 영향을 미치는 관능기.
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Date Published: 12/1/2021
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주제에 대한 기사 평가 흡광도 에 영향 을 미치는 요인
- Author: 김범철 교수의 [호수의 과학]
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- Date Published: 2021. 5. 3.
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어떤 요인이 흡광도에 영향을 줍니까?
1. What are absorbance and transmittance? 흡광도(A)는 광학 밀도(OD)라고도 하며 요소가 흡수하는 빛의 양입니다.
빛이 물체에 부딪힐 때, 일반적으로 흡수된 빛의 파장이 물체의 전자 여기와 일치하기 때문에 분석 물질의 분자 또는 원자가 빛을 흡수할 수 있습니다. The rest of the light is transmitted, in other words, it passes through the object, which is called transmittance (T).
The more analyte is found in the solution, the lower transmittance will be due to the more light is absorbed by it. 2. Why measure absorbance? In biochemistry, biology or chemistry, when analyte absorbs the light at a specific wavelength, a unique relationship exists between the individual atom/molecule and its UV Vis spectrum. This relationship can be used for: Qualitative analysis – determining the presence of certain substances.
For example, determining pesticide residues in food, identification of contamination such as COD in water, identification of nucleic acid such as COVID-19 testing. Quantitative analysis – determining the amounts of certain substances.
For example, determining the concentration of substances in air such as PM2.5, determining the concentration of harmful substance such as mercury and asbestos in makeup, measuring calcium and protein content in dairy products. 3. How is absorbance detected? Light source
The all-important thing for light transmission or absorption measurement is the light source.
Different light sources can be used for absorbance measurements. They differ in the spectral wavelength range, in their optical intensity and in the light stability. 견본
관심 있는 물질의 흡광도를 측정하기 위해 일반적으로 적절한 부피의 관심 분석물이 포함된 용액을 큐벳에 넣어야 합니다.
관심 있는 물질의 흡광도를 측정하기 위해 일반적으로 적절한 부피의 관심 분석물이 포함된 용액을 큐벳에 넣어야 합니다. 큐벳 재료
세 번째로 중요한 것은 올바른 큐벳 재료를 선택하는 것입니다. 큐벳의 재료는 항상 투명하고 매끄 럽습니다. 연구원은 재료보다는 용액의 흡광도에 관심을 가지고 있기 때문에 최대 광 투과율과 적은 빛 산란을 보장합니다. The appropriate blank
In order to correct undesired absorbance of absorbance measurements, such as light scattering, a blank is measured in parallel to samples. The appropriate blank includes all components except the analyte of the assay.
Side Note : Particles in the solutions scatter the light, it will increase the measured absorbance value since they block the light path, as a result, less light reaches the detector.
In order to correct undesired absorbance of absorbance measurements, such as light scattering, a blank is measured in parallel to samples. The appropriate blank includes all components except the analyte of the assay. Detector of absorbance measurements
A UV-VIS spectrophotometer is an instrument designed to measure absorbance in the UV-VIS region using the Beer-Lambert law. Measures the intensity of light passing through a sample solution in a cuvette and compares it to the intensity of the light before passing through the sample. 4.Theoretical background of absorbance measurements Detection path in cuvettes
A solution contains interested analytes with known absorbance characteristics is placed into a cuvette. Then insert the cuvette into the instrument chamber, the absorbance reader will determine the light absorbance by calculating the optical density difference before and after passing the sample.
(Light that does not pass through the detector is either absorbed or scattered. The scattered part can be corrected by measuring appropriate blanks, and is subtracted from this value to obtain real absorbance of the interested substance.) Absorbance in chemistry and life sciences
After the absorbance measurement, the result is a value given in either transmission or optical density. Whereas, quantification of a substance in solution is the goal of the measurement, then the obvious question is how to convert the known signal into the concentration value. Generally, we can employ the Beer-Lambert law to get it.
After the absorbance measurement, the result is a value given in either transmission or optical density. Whereas, quantification of a substance in solution is the goal of the measurement, then the obvious question is how to convert the known signal into the concentration value. Generally, we can employ the Beer-Lambert law to get it. Beer-Lambert Law
The Beer-Lambert law is very helpful as it allows quantification of absorbing substances without the need to add any other reagents, it describes the relation of absorbance, path length and concentration of an absorbing substance:
A=εlc
A – absorbance
ε – molar attenuation coefficient or absorptivity of the attenuating species – M‾¹cm‾¹
l – optical path length – cm
c – concentration of the attenuating species- M It says that there is a linear relationship between the concentration, absorbance, path length and molar optical coefficient, which enables the concentration of solution to be calculated by measuring its absorbance.
For instance, in a standard cuvette the path length is 1 cm. For an absorbing substance and a specific wavelength, the extinction coefficient (ε) is a constant specific, usually the absorbance maximum of the substance, which provides information on how strongly the specific substance absorbs light at the specific wavelength.
As an example, the molar extinction coefficient for oligonucleotides is 32.4 µl*cm-1*µg-1. Therefore, a solution of 1 µg/µl oligonucleotides with a path length of 1 cm has an absorbance of 32.4 OD. 5.What will affect your absorbance measurements? Does cuvette material affect absorbance?
When measuring in the UV-range, as it is required for nucleic acids or NADH, the UV-transparent cuvette is requisite to finish the measurement. Otherwise, you will get the maximum absorbance in all samples in this absorbance measurement because the material of cuvette absorbs UV light. We have various cuvette material, and there are 5 common material you can choose to use, Plastic, Glass, UV Quartz (JGS-1), VIS Quartz (JGS-2), IR Quartz (JGS-3) cuvette, the same material has the same spectrum transmitting, but different fabrication has different light transmittance.
As an example, for our JGS-1 quartz glass material cuvette, Glued cuvette has 80% light transmittance, but the All Fused quartz cuvette has 83% light transmittance, and the highest applicable temperature is not the same. Does cuvette size affect absorbance?
According to the Beer-lambert Law, when the extinction coefficient (ε) and the path length (l) are constant, the absorbance (A) is proportional to the concentration (c) of the sample. When the ε and the c are constant, the absorbance is directly proportional to the length of the light path, it is also equal to the inner width of the cuvette.
The path length affects absorbance. With a longer optical path length, the light has to travel through more solution, and can hit more molecules or atoms, and be absorbed more.
For a low concentration sample, the analytes may not absorb enough light with short path length cuvette, then the measurement is less effective.
According to the Beer-lambert Law, when the extinction coefficient (ε) and the path length (l) are constant, the absorbance (A) is proportional to the concentration (c) of the sample. When the ε and the c are constant, the absorbance is directly proportional to the length of the light path, it is also equal to the inner width of the cuvette. The path length affects absorbance. With a longer optical path length, the light has to travel through more solution, and can hit more molecules or atoms, and be absorbed more. For a low concentration sample, the analytes may not absorb enough light with short path length cuvette, then the measurement is less effective. Will sample volume affect absorbance？
For a standard cuvette, fill the cuvette about 80% full of the solution you wish to test is enough.
But for a micro quartz cell or flow cuvette, and the sample you use is small enough to 10-400ul, then it’s important to make sure there is enough sample in the cuvette for the light to pass through. As we said before, the measurement will be less effective if the analyte can’t absorb enough light.
For a standard cuvette, fill the cuvette about 80% full of the solution you wish to test is enough. But for a micro quartz cell or flow cuvette, and the sample you use is small enough to 10-400ul, then it’s important to make sure there is enough sample in the cuvette for the light to pass through. As we said before, the measurement will be less effective if the analyte can’t absorb enough light. Will Z-Dimension affect absorbance?
8.5mm, 15mm, 20mm Z-Dimension are the common distance of cuvette center window to the cuvette bottom.
If you use 15mm ZD black wall cuvette to a 8.5mm Z-height machine, the light beam will smission too low to tranmist the black wall of cell, which can’t reach the dector because it is blocked, then you will get 0% light transmission.
We have varieties of absorption cuvettes with different ZD shown as below, such as standard pathlength, long pathlength, or flow cell.
There are more Self-masking cuvettes, please go to our web or contact us for quote if you want to buy cells. 큐벳 측면에 지문이 남으면 테스트 결과에 어떤 영향을 줍니까?
큐벳 창의 지문은 대상 광선 투과를 방해하여 부정확한 측정을 유발할 수 있습니다. 지문이 빛을 흡수하기 때문에 약간 더 높은 흡광도 판독값이 나타나며 측정된 농도가 실제 농도보다 더 높아집니다.
큐벳 창의 지문은 대상 광선 투과를 방해하여 부정확한 측정을 유발할 수 있습니다. 지문이 빛을 흡수하기 때문에 약간 더 높은 흡광도 판독값이 나타나며 측정된 농도가 실제 농도보다 더 높아집니다. 광 경로의 교란이 있는 경우 흡광도 결과는 어떤 영향을 받습니까?
빛의 경로에 어떤 것이 있으면 측정된 흡광도의 판독값이 증가합니다.
Usually, these are air bubbles in the sample, condensation on a lid, dust, scratches or fingerprints on the window of the cuvette. Therefore, checking the cuvette just before measurement is recommended.
We have bubble-free New-Arrival cuvette to reduce the air bubble influence in the measurement. How does pH affect light absorbance?
When the pH of the solution changes, there are ionization in some of the molecules of the solution, then the structure of molecular changes, which will affect the determination of absorbance.
As an example, for anthocyanin measurement of lycium ruthenicum, it is less accurate if measure the anthocyanin concentration in a single PH environment, because their color and absorbance changes with pH. 안토시아닌은 pH가 1.0일 때 2-페닐 벤조피란의 적색 형태이고, pH 4.5에서 무색 메탄올 형태가 염기성이며 전자 형태의 흡광도가 후자보다 훨씬 높다. 따라서 같은 용액이지만 pH가 다른 경우 흡광도 판독값이 다르기 때문에 농도가 달라지고 실제 농도가 같더라도 결론이 정확하지 않습니다. As a result, pH-differential method is a better way to determine the concentration of anthocyanin of lycium ruthenicum. Does temperature affect UV Vis absorbance analysis?
Temperature affects absorbance values.
Different solvents’ interact performance are not exactly the same at different temperatures. It’s vital for an effective measurement to control the heating temperature especially some reaction undergoing at specific temperature. Solution parameters will change with the temperature changes:
Rate of reaction-The reaction rate changes when temperature changed. This can cause a change in the activity of the sample. Enzymatic/biomolecular reactions are very sensitive to temperature.
Solubility of a solute-Solubility is affected with variations in temperature. Poor solubility may result in imprecise absorption.
Expansion or contraction of the solvent-This may lead to a change in the concentration of the solution and affect the absorbance, as absorbance is linearly related to concentration.
Schlieren effect-This effect may occur with temperature changes, leading to a series of convective currents which may change the true absorbance. For measurement of total nitrogen in water with spectrophotometer, in alkaline aqueous solution (>60℃), Potassium persulfate can be decomposed to produce potassium bisulfate and atomic oxygen, then the NO2-, NH4-, organic nitrogen in sample can be oxidized to nitrate nitrogen by atomic oxygen at 120-124℃. And we can determine the absorbance and concentration with this solution. But there will be residual potassium persulfate in the solution to affect the absorbance if the temperature-controlled fail to meet the requirement. Potassium persulfate has a strong absorption peak at 220nm, which coincides with the absorption wavelength of total nitrogen. This absorption characteristic gradually weakens with the continuous decrease of potassium persulfate. Temperature control can be achieved using high-performance nomothermal System for UV Vis spectrophotometry. How does stray light affect the optical density (OD) reading?
Stray light is defined as light in the system at wavelengths (colors) other than the one intended, that is to say, stray light is not from the instrument’s light source and does not follow the optical path but reached the detector, which causing a deviation at the corresponding wavelength.
Therefore, the optical density measured by the detector is higher than the true OD. In other words, the measured absorbance of samples is lower than the true absorbance due to the stray light contribution.
There is one method to reduce stray light in these systems is the use of double monochromators. 6. How to reduce the effect on absorbance as mentioned above? As we said before, different absorbance measurement requires different pH and temperature environment control, and stray light is a complex subject to figure out the exact problem to solve.
In this part, we will solve the influencing factors of cuvette for absorbance, right cuvette choosing, cuvette using and maintenance: How to choose the right absorption cuvette for absorbance studies?
In our previous article, 7 Things to Think About When Ordering a Cuvette, we have attempted to provide answers to choose the right cuvette, it is specified in the aspects of cuvette material, pathlength, Z-dimension, volume, cover type, cell shape and etc.
There will be a further explanation on path length choosing of cuvette in the following part: How to choose the right path length of cuvette?
The proper pathlength of cuvette is to ensure absorbance values are within the dynamic range of the detector.
Pathlength choosing of cuvette depends on the concentration of a sample and the chamber of instrument, which decide the upper light path length of detection. What time will use “long path” cuvettes?
When the concentration of the sample is too low to be measured using a standard 10mm optical path length cell, and concentration is difficult in cases where the sample vaporizes or undergoes a chemical or molecular structural change during the concentration process, then a cell with a longer optical path length is used to enable the optimum absorption sensitivity of absorption measurement. For instance, a well-known study using a long pathlength cell is the turbidity analysis of water. 50mm and 100mm cuvettes are often used for analyzing samples with a low turbidity. There are cuvettes with optical path lengths of 20mm, 30mm, 40mm, 50mm, 100mm, and other long path length cells, made of JGS1 Quartz, 200-2500nm. We also have long pathlength cuvettes made of optical glass, it range from 10-100mm. Click here to see more, and here to see the Glued* one . When will use “short path” cuvettes?
With regards to some high-concentration samples, it allows measurement with a 10-mm standard path length cell after diluting.
But for some high concentration samples and can’t be diluted easily, for example, due to the analyte may interact with the solvent, diluting a sample may cause a change in the absorbance (i.e., shift in the peak wavelengths). In this case, a short path length cuvette is used to measure high-concentration samples without diluting effectively. For instance, A well-known study using a short path length cell is solution analysis in the NIR region. If a 10mm standard pathlength cell is used for absorbance measurement in the NIR region, saturation often happens because light absorption by the solvent, making it impossible to determine the absorption of the analyte. Then a short path length cell is used to prevent absorption saturation because of the solvent. There are short-path cells with optical path lengths of 0.1mm, 0.2mm, 0.5mm, 1mm, 2mm, 5mm, and etc. We also have short pathlength cuvettes with macro window, air-tight, or narrow width as below. We have more short path length cuvettes, such as 1.5mm, 2.5mm, 3mm, 6mm, and optical glass cuvette is also in stock. If you want to buy quality and affordable cuvette, please contact us or go to our web ecuvette.com. After we studied the cuvette choosing of material, pathlength, volume, Z-Dimension and ordered the right cuvette, it’s time for us to learn how to clean the cuvette if we didn’t buy the disposable one. How to clean to the outer window of cuvette?
The cuvette should be replaced immediately if there are cracks, chips or scratches on the window, or result in poor performance, less effective result and waste your sample and time, it is much expensive than the cost of a replaced cuvette. 큐벳 창에 있는 지문의 경우 적절한 큐벳 청소가 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 실제 성능보다 더 높은 흡광도 판독값을 얻게 됩니다.
큐벳 창의 지문이나 기타 얼룩을 고품질 렌즈 용지 를 사용하여 닦아내는 것은 큐벳 창을 깨끗하게 유지하는 데 사용하는 것이 안전합니다.
주의사항 : 종이타월, Kimwipes 또는 이와 유사한 종이 제품을 사용하지 마십시오. 대부분의 종이 제품에는 연마제가 사용되기 때문에 큐벳의 표면이 긁힐 수 있습니다. 긁힌 자국은 빛의 산란을 일으키고 궁극적으로 측정에 영향을 미칩니다. At the end of the day, clean your cuvettes thoroughly, air dry completely and store them in a cuvette rack or other suitable container. If the cuvettes didn’t dry completely and stored wet, they may dry with residue sample of previous application on the measuring surfaces, which will affect subsequent measurements.
큐벳을 청소하기 위해 초음파 세척 수조를 사용하지 마십시오. 또는 이러한 욕조에서 사용되는 고주파로 인해 큐벳이 손상되거나 부서질 수 있습니다.
따라서 큐벳을 위한 적절한 세척 솔루션은 사용 수명을 늘리고 보다 일관된 결과를 제공할 것입니다.
흡광, 흡광 측정, 흡광 assay란
흡광 수식
A = Log 10 (I 0 /I)
이때 I 0 는 입사광의 세기이며, I는 샘플을 통과한 광선의 세기입니다.
T = I/I 0 및 %T = 100(T)
이 수식은 % 투과율로부터 흡광을 계산할 수 있도록 합니다.
A = 2 – log 10 (%T)
비어-람베르트 법칙을 이용한 농도 결정
샘플의 농도는 다음과 같이 표시되는 비어-람베르트 법칙을 이용한 흡광으로부터 계산할 수 있습니다.
A = ε * c * p
이때, ε은 몰 흡수도 또는 몰 흡광 계수로, 단위는 L mol-1 cm-1입니다.
c는 mol/L로 표시된 용액의 용질의 농도입니다.
p는 샘플의 경로 길이로, 큐벳 1cm와 같이 cm로 표시됩니다.
하루에도 몇 번씩 하는 흡광도 측정! 제대로 알고 하자! > 단백질 연구
하루에도 몇 번씩 하는 흡광도 측정! 제대로 알고 하자!
DNA와 RNA 등 핵산 정량, Bradford assay와 BCA assay 등 다양한 방법의 단백질 정량. 바이오 실험을 하는 연구자라면
하루에도 몇 번씩 시료의 흡광도를 측정하고 있다.
그렇다면 흡광도는 어떤 원리로 측정되는 것이며, 흔히 얘기하는 OD값(optical density)은 무엇일까?
이 원리를 이해하기 위해서는 아래 두가지 원리를 이해해야 한다.
1. Lamber-Beer의 법칙
2. 모든 물질은 고유의 흡광 파장을 갖는다
Lamber와 Beer는 각각 하나의 원리를 찾고 법칙을 성립했다.
Lamber는 ‘흡광도’와 ‘빛이 지나간 길이’가 비례함을 확인했는데, 그림으로 확인하면 아래와 같다.
만약 위와 같이 길이가 다른 큐벳(cuvette)에 같은 물질(ex.물)을 넣고 한쪽에서 빛을 쏘아주면, 그 물질이 빛의 일부를 흡수한다.
흡수되지 않은 남은 빛은 물질을 통과하여 반대편에서 측정된다.
그런데 샘플을 향해 쏘아준 빛(그림에서 100%)은 큐벳 길이가 길수록 더 많은 물분자를 만난 후 반대편으로 통과된다.
따라서 각각의 물분자들이 모두 빛을 흡수했으므로 큐벳 길이가 길수록 반대편으로 통과된 빛은 적을 것이다.
즉 반대편으로 통과되어 나오는 투과율은 흡수층의 두께(빛이 샘플을 지나간 길이)에 반비례하며, 샘플의 흡광도는 흡수층의 두께에 비례한다.
다음은 Beer의 법칙이다. 아래 그림과 같이 특정 물질이 농도별로 들어있는 시료가 있다.
같은 길이의 큐벳을 사용하여 흡수층의 두께(큐벳의 길이)는 동일하다.
이 경우 장비에서 넣어준 빛 대비 시료를 통과하여 투과된 빛의 양은 어떨까?
Lamber의 법칙에서 설명한대로, 각각의 물질 분자는 빛을 흡수한다. 따라서 고농고일수록 시료 내에 빛을 흡수할 수 있는 분자가 더 많이 존재하는 것이다.
즉 반대편으로 통과되어 나오는 투과율(10%, 1%, 0.1%)은 시료의 농도에 반비례하며, 시료의 흡광도는 농도에 비례한다.
흡광도 측정에 사용되는 두번째 원리는 ‘모든 물질은 고유의 흡광 파장을 가진다’는 것이다.
예를들어 아래 그림은 순수한 물의 흡수 스펙트럼이다.
(이미지 출처: https://www.researchgate.net/figure/3-Absorption-spectrum-of-pure-water_fig16_314448200)
보는 것과 같이 물은 970 – 980 nm 파장의 빛을 가장 많이 흡수하는 것을 볼 수 있다.
이처럼 물 뿐만 아니라 모든 물질은 고유의 흡광 파장을 갖고있다.
우리가 핵산을 260 nm에서 측정하는 것도 이 원리를 이용한 것인데, 핵산의 최대 흡수 파장이 260 nm이기 때문이다.
즉, 내 시료가 260 nm 빛을 많이 흡수하면 핵산 농도가 높은 것으로 이해하는 셈이다.
그렇다면 위의 원리들이 OD값에 어떻게 적용될까?
우선 흡광도와 투과율의 관계는 아래와 같다.
흡광도 측정 장치는 시료를 투과하여 나온 I 1 을 측정하여, 역으로 시료의 흡광도를 계산한다.
따라서 투과된 빛이 많으면 많을수록 시료가 흡수한 빛은 적은 셈이다.
이 때문에 흡광도와 투과율은 정비례가 아닌 반비례 그래프인 ‘-log’를 사용한다.
위 그림에서 Transmssion은 I 0 /I 1 = 10% 이고, 10%=0.1=10-1으로 표기할 수 있다. 따라서 -log10-1 = 1이다.
이 수식을 적용하면 일반적으로 흡광도 측정장치에서 사용되는 ~OD4가 의미하는 흡광도는 아래와 같다.
위 수식을 통해 투과율을 가지고 흡광도를 계산할 수 있다. 그렇다면 이를 시료의 농도에 어떻게 반영할 수 있을까?
이 때, 추가로 ε(물질 고유의 흡광계수)와 l(cuvette의 폭) 정보가 필요하다.
A = ε l c
A: 흡광도
Ε: 물질 고유의 흡광계수
l: pathlength (cuvette의 폭 혹은 마이크로플레이트의 용액 높이)
c:흡광물질의 농도
ε (물질 고유의 흡광계수)는 ‘특정 물질이 특정 파장의 빛을 얼마나 흡수하는가’를 나타내는 지표라고 할 수 있다.
예를들어 double strand DNA의 260 nm에서 ε값은 50이며, single strand RNA는 40이다.
이러한 정보는 인터넷을 통해 얻을 수 있다.
이는 표준용액을 사용하지 않는 ‘절대정량’에 활용하기 위한 방법이다.
만약, 마이크로플레이트를 사용하여 농도를 알고있는 표준용액과 함께 정량을 하고있는 경우라면,
ε값과 l값을 확인하지 않아도 무방하다.
동량의 시료를 넣으므로써 l값은 고정되기 때문이며, 표준용액을 통한 정량이므로 ε값도 통제된다.
즉, 표준용액의 농도와 흡광도 관계를 확인하므로써, 내 시료의 흡광도를 통해 농도를 알아내는 방식이다.
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왜 흡광도가 1이 넘으면 안되는걸까?
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화합물의 분석에 있어서 UV-Vis Spectrophotometer는 굉장히 강력한 도구이다. 특히나 반응에 따라서 색이 변화하는 것을 관찰하는 경우에는 이처럼 민감하게 측정해줄 수 있는 분광기계가 필수적이다. 물론 UV 쪽 파장을 쬐어서 흡광도도 측정할 수 있기 때문에, 형광을 발하는 시료도 측정이 가능하다.
UV-Vis Spectrophotometer는 UV부터 Visible 영역의 파장까지 빛의 파장을 바꿔가면서 화합물의 흡광도를 측정하는 기기인데, 처음 이 기계 사용법을 배울 당시에 흡광도가 1.0이 넘으면 신뢰도가 떨어지는 결과가 나온다 정도로만 설명을 들어서, 궁금했던 기억이 있다. 그래서 막연하게 1.0이 넘으면 다시 농도를 낮춘 용액으로 실험을 하곤 했다. 머릿속에는 Beer-Lambert Law만 맴돌고 있었기도 했고 말이다.
[Fig. 1] 흡광도 곡선의 예Beer-Lambert Law의 공식을 기억해보면 A=εbc라는 공식이 먼저 떠오른다. 흡광도는 셀의 너비, 농도, 흡광계수에 비례한다는 공식이다. 흡광계수는 물질마다 다른 상수 값이고, 셀의 너비는 거의 1 cm로 규격화되어 나오기 대문에 흡광도는 농도에 비례한다는 공식을 얻게된다. 하지만 이 흡광도가 1이 넘으면 안되는 이유에 대해서는 다음과 같은 공식이 필요하다. 흡광도는 Beer-Lambert 법칙 외에도 입사한 빛의 세기와 투과한 빛의 세기의 비율로 나타낼 수 있다.
여기서 A가 1인경우 l 0 /l=10, l 0 =10 × l 가 된다.
이 의미가 입사광선이 투과된 빛의 10배라는 것이니까 입사 100이 되었을 때 투과 10이 되었다는 것이고,
즉 90의 빛이 흡수 되었다는 것을 의미. 흡광도가 2가 되면 99% 3이되면 99.9%가 흡수되었다는 것을 알 수 있다.
그런데, Beer Lambert 법칙을 성립시키기 위한 가정이 두가지 있다.
1. 발색단, 즉 빛을 흡수하는 분자들은 서로 다른 분자들에 영향을 미치지 않는다. 즉 용액이 이상 용액이라는 가정
2. 용액 속에 있는 각 분자들은 동일하게 광자를 흡수할 수 있는 가능성을 가지고 있다.
이러한 가정이 높은 농도의 용액에서는 성립하지 않을 수 있다는 것이 중요하다.
왜냐하면 농도가 높아지면서 한 분자가 다른 한 분자를 가릴 수 있기 때문. 그렇기 때문에 실제로 측정되어야 하는 이상 흡광도에 비해서 낮게 측정될 수 밖에 없다는 의미이고, 이것은 결국 점근선을 통해 나타나는 결과에도 영향을 미치게 된다.
오래된 기계 같은 경우에는 이러한 오류를 보정할 수 없다고 한다. 그래서 흡광도 0.1~0.6에서 찍는 것이 결과를 신뢰할 수 있다고 말할 수 있다는 것이고, 그래서 어떤 시료가 흡광도가 1이 넘게 되면 이를 희석시켜서 사용할 필요가 있다는 의미이다.
최근에 나온 기계들은 흡광도 2.0까지 보정이 가능하다고 한다. 어떻게 보정하는지에 대해서는 잘 모르겠지만, 보정이 가능하거나, 그렇지 않거나 어쨌든 흡광도 곡선을 그렸을 때, Linear하게 나와야 한다는 것이 중요하다고 할 수 있겠다.
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고등학생을 위한 분광광도법 : (1) 기초
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바쁘디 바쁜 고등학생이 분광광도계(spectrophotometer)를 사용할 일은 거의 없다. 보통의 경우 이공 계열의 대학교 1학년, ‘일반화학실험’에서 처음 접한다. 스무 살 성인 되고, 대학생 되었다고 해서 한 번도 사용해 본 적 없는 분석 기기의 원리부터 작동법까지 단번에 이해될 리는 없다. 비교적 가벼운 수준의 분광학 내용이지만 생소함이 더 크기 때문에 어려운 게 당연하다.
사실, 이공 계열로 진학을 희망하는 고등학생들의 경우, 분광법을 간단하게라도 알면 자유탐구나 과제연구에 활용할 수 있는 여지가 꽤나 많다. 초반 진입 장벽이 있긴 하지만 가볍게 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광기 정도만 사용해도 결과의 퀄리티를 바꿔줄 수 있다. 물론, 학교에 분광광도계가 구비되어 있어야 가능한 일이긴 하다.
요즘은 과학고나 영재고가 아닌 일부 일반고에서도 예산을 확보하여 관련 기기들을 구비해놓고, 학생들의 과제연구를 지원해주는 것 같다. 개인적으로는 많은 학생들이 쉽게 접할 수 있도록 기기가 보편화되었으면 좋겠다.
대부분의 사람들에게는 이 글이 관심 밖의 내용이겠지만, 당장 분광광도계를 사용해야 하고 분석 원리를 알아야 하는 누군가에게 도움이 될 수 있었으면 한다. 계획 없이 쓰기 시작한 것이라 분량이 어느정도가 될지 가늠이 안되지만 최대한 풀어서 설명하려 하며, 아마도 기초, 정성분석, 정량분석의 순서가 될 것 같다.
이번 글에서는 주로 분광광도법의 원리와 비어-람베르트 법칙에 대한 이야기를 하려 한다.
고등학생을 위한 분광광도법 : (1) 기초
– 분광광도계의 분석 원리와 Beer-Lambert 법칙 –
1. 물질에 빛을 쬐어주면
분광광도법(spectrophotometry)은 빛을 이용하여 물질 정보를 알아내는 분석법이다. 물질에 빛을 쬐어주면, 물질을 구성하는 입자(분자)들이 빛의 영향을 받는다.
분자가 빛을 흡수하면 분자의 에너지가 높아진다. 쉽게 말해 들뜬상태(excited state)가 된다. 분자가 흡수했던 빛을 방출하면 에너지는 낮아진다. 분자의 가장 낮은 에너지 상태를 바닥상태(ground state)라 한다.
우리가 쬐어주는 빛은 파동이면서 입자(알맹이)다. 빛 알맹이는 파장에 따라 에너지가 다르다. 빛 알맹이 하나의 에너지는 다음과 같이 표현할 수 있다.
E = hυ = hc / λ
파장 λ 이 길수록(진동수 υ 가 작을수록) 에너지가 작고, 파장 λ 이 짧을수록(진동수 υ 가 클수록) 에너지는 크다. 따라서 쬐어주는 빛의 파장에 따라 분자에 미치는 영향이 다르다.
그림 1. 빛의 스펙트럼 [출처] https://www.khanacademy.org/science/biology/photosynthesis-in-plants/the-light-dependent-reactions-of-photosynthesis/a/light-and-photosynthetic-pigments
전자레인지의 마이크로파(microwaves)는 분자의 회전 운동을, 적외선(infrared)은 분자의 진동 운동 상태를 변화시킬 수 있다. 가시광선(visible light)과 자외선(ultraviolet)은 전자를 더 높은 오비탈로 들뜨게(전자 전이) 할 수 있다. 자외선보다도 파장이 짧은 X-선은 분자의 결합을 깨버리거나 전자를 제거해 이온을 만들기도 할 만큼 강력하다. 물질로부터 어떤 정보를 얻고 싶은지에 따라 사용하는 빛의 파장이 달라진다.
그림 2. 바닥상태(gs)와 쬐어준 빛의 파장에 따른 전자전이, 진동전이, 회전전이
2. 비어-람베르트 법칙(Beer-Lambert Law)
분석을 위해서는 무엇이 필요할까? 일단 분석할 시료(분석 대상)가 필요하다. 그리고, 분석에 사용할 빛(광원)이 필요하다. 빛을 공급해주고 분석까지 해주는 장치가 분광광도계이다.
만약, 학교에 자외선-가시광선 분광광도계(UV-Vis Spectrophotometer)가 있다면, 그 장치는 자외선과 가시광선 영역대의 빛을 쏴줄 수 있다. 아마도 대부분 200nm ~ 1000nm 정도 범위의 빛을 쏴줄 것이다. 장치 내부에는 빛의 공급원인 램프 광원(Light Source)이 어딘가에 있다. 램프 광원의 종류에 따라 빛의 파장 영역이 달라진다.
장치(분광광도계)는 어떻게 시료를 분석할까? 알고 보면, 그리 복잡하지는 않다.
그림 3. 분광광도계의 구조
장치를 작동하기 전에는 내부가 깜깜해야 한다. 빛이 1도 없어야 한다. 장치를 작동시키면, 광원으로부터 유일한 빛이 특정 세기(P 0 )로 나온다. 우리는 빛이 지나갈 경로에 시료를 미리 놓아두어야 한다.
빛이 시료를 통과하면서 일부가 시료에 흡수된다. 흡수되지 않고 통과한 나머지 빛은 검출기(detector)에 도달한다. 만약, 시료가 빛을 흡수했다면 검출기에 도달한 빛의 세기(P )는 처음 쏴준 빛의 세기(P 0 )보다 약할 것이다.
장치는 처음 쏴준 빛의 세기(P 0 )와 검출기에 도달한 빛의 세기(P )를 비교한다. 시료가 얼마나 빛을 흡수했는지 알 수 있다. 그리고 우리에게 결과를 알려준다.
그림 4. 시료 분석 과정 [출처] Fundamentals of Analytical Chemistry 9th, Skoog, Fig. 24-5 (a)
장치는 우리에게 투광도(transmittance, T ) 형태로 정보를 준다. 투광도는 ‘처음 빛의 세기(P 0 )’와 ‘검출된 빛의 세기(P )’의 분율이다.
만약, 장치가 빛을 100의 세기로 쐈는데 검출기에 도달한 빛의 세기가 20 이었다면, 투광도 T 는 0.2 이라고 알려준다. 투광도 T 는 0 에서 1 사이의 값을 갖는다. 알기 쉽게 백분율 투광도(%T, 100T )로 표현하기도 한다.
그렇다면, 시료는 빛을 얼마나 흡수했을까?
통과한 비율인 투광도가 0.2면, 흡수한 비율은 0.8 아닌가?라고 되물을 수도 있겠다. 하지만 시료가 빛을 흡수한 정도를 나타내는 흡광도(absorbance, A)는 다음과 같이 정의된다.
아쉽지만, 투광도 T 와 흡광도 A 는 로그 관계를 갖는다. 투광도 T 에 – log 를 취한 것이 흡광도 A 이다. (왜 로그 관계를 갖는지는 ‘분석화학’ 책의 ‘비어-람베르트 법칙의 유도과정’ 부분을 통해 쉽게 찾을 수 있다. 이 글 수준과는 맞지 않기 때문에 생략한다. 그래도 궁금하다면, <더보기>의 링크를 참고해보자.)
투광도와 흡광도 사이의 관계를 살펴보자. 빛이 시료에 전혀 흡수되지 않았다면, 빛이 모두 투과하여 검출기에 도달한다. 따라서 P 0 = P , T = 1 이 되어 흡광도 A = 0 이 된다. 반면, 10 % 의 빛만 투과했다면(T = 0.1), 흡광도 A = 1 이다. 투광도 T, 흡광도 A의 관계를 나타내면 다음 표와 같다.
표 1. 투광도(T), 퍼센트투광도(%T), 흡광도(A) 사이의 관계
흡광도는 분석 과정에서 매우 매우 중요하다. 왜냐하면, 시료 내 빛을 흡수하는 화학종의 몰농도(c )에 따라 흡광도(A )가 달라지기 때문이다. 그것도 선형(linear)으로 비례하는 관계이다. ( y = ax 꼴 )
흡광도 A 와 시료의 몰농도 c 사이 관계를 나타내는 법칙이 바로 ‘ 비어 법칙(Beer’s Law) ‘이다.
그림 5.1. 비어 법칙
흡광도는 빛이 물질을 통과하는 길이(광로, path length)에 따라서도 달라진다. 예상대로, 통과해야 하는 길이 b 가 길어질수록 흡광도(A )는 높아진다. 이것을 ‘ 람베르트 법칙(Lambert’s Law) ‘이라고 한다.
그림 5.2. 람베르트 법칙
농도 c 와 빛의 통과 길이 b 에 대한 두 법칙을 조합한 것이 “비어-람베르트 법칙(Beer-Lambert Law)”이다.
그림 5.3. 비어-람베르트 법칙
분광 광도계로 흡광도를 측정할 때, 분석할 물질(시료)을 셀(cell) 또는 큐벳(cuvette)이라고 불리는 용기에 담게 된다. 큐벳의 가로, 세로 길이가 1 cm인 것을 사용하는 것이 보편적이다. 이에 빛이 통과하는 거리인 b 값은 거의 고정되어 있기에 상수처럼 취급할 수 있다.
몰 흡광 계수(molar absorptivity, ε)는 물질마다 가지고 있는 고유한 값이다. 몰 흡광 계수가 크다는 것은 물질이 빛을 잘 흡수한다는 뜻이다. 만약, 물질의 농도를 정확하게 알고 있다면, 흡광도를 측정하여 그 물질의 몰 흡광 계수를 알아낼 수 있다. 또는 반대로 몰 흡광계수를 아는 물질의 흡광도를 측정하여, 미지의 농도 값을 찾아낼 수도 있다.
3. 정리
내용을 정리해보자. 물질에 빛을 쬐어주면, 물질은 빛을 흡수한다. 분광광도계는 물질이 얼마나 빛을 흡수하는지를 투광도(T )나 흡광도(A )의 형태로 알려준다. 흡광도는 물질의 농도에 비례하기 때문에 흡광도를 측정하면, 농도를 모르는 물질의 농도를 알아낼 수 있다. 흡광도와 농도의 관계를 이용하기 위해서는 비어-람베르트 법칙을 사용한다.
끝까지 읽어주셔서 감사합니다.
(1) 기초편 – 끝 –
* 다음글 : 정성분석 https://stachemi.tistory.com/130
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흡광광도법(UV/Vis)을 이용한 미생물의 증식 측정
☞유도기(lag phase, induction phase)
유도기는 균을 새로운 배지에 접종하거나 배양할 때 그 배지에 적응하는 시기를 말한다.
새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소 단백질을 생합성하는 시기로 효소단백질 합성이 왕성하게 일어난다. 세포의 크기가 커지며 호흡 활성도가 높은 시기이다.
이 시기 세포내의 RNA량은 현저하게 증가하나 DNA량은 변화하지 않는다.
유도기는 미생물의 필수 영양분의 유무에 따라 시간이 길어지거나 짧아질 수 있다.
☞대수기(logarithmic phase, exponential phase)
미생물의 세포가 최대 속도로 분열하고 증식하는 시기를 대수기라고 한다.
이 시기에는 세대시간, 세포의 크기가 일정하다.
세포질의 합성 속도와 세포수의 증가는 비례하며
증식 속도는 배지의 영양, pHM 온도, 산소분압 등의 환경에 의해서 결정된다.
세포의 생리적 활성이 가장 강하며 물리적, 화학적 처리에 대해 감수성이 높은 시기이다.
또한 원핵생물이 진핵생물보다 빠르며, 작을수록 표면적으로 유리하게 증식한다.
☞정상기(stationary phase, maximum phase)
정상기는 생균수는 일정하게 유지되고 총 균수는 최대가 되는 시기이다.
일부 세포가 사멸하고 다른 일부의 세포는 증식하여 사멸수와 증식수가 거의 같다.
영양물질의 고갈, 대사생산물의 축적, 배지 pH의 변화, 산소공급의 부족 등
부적당한 환경이 되어 생균수가 증가하지 않는다.
또한 내생포자를 형성하는 세균은 포자를 형성한다.
☞사멸기(death phase, phase of decline)
사멸기는 생균수가 감소하는 시기이다.
각종 가수분해 효소의 작용으로 자기소화(autolysis)가 일어나 세포가 용해되고 사멸한다.
흡광광도법 측정원리
흡광은 물질의 광학적 성질중 하나로 물질이 특정 파장의 빛을 흡수하는 성질을 의미한다.
특정 파장의 빛을 받은 전자는 빛 에너지를 흡수하여 낮은 전자궤도에서 높은 전자궤도로 이동하게 된다.
이러한 전자궤도의 특성에 따라 흡수파장이 달라진다.
이때 흡광도를 이용하면 특정 파장을 흡수하는 물질에 대해 정량 분석이 가능하다.
용액에 흡수되는 빛의 양은 그 용액의 농도와 관계가 있는데
이를 이용하여 용액 중의 물질을 정량하는 방법이 흡광광도법이다.
이 방법은 시료물질, 그 용액에 적당한 시약을 가하여 발생시킨 용액 등의 흡광도를 측정하여
시료 중의 목적 성분의 농도를 구한다.
주로 자외선(180~320nm) 및 가시광선( 320~800) 영역에서 빛의 흡수를 이용하여
액체의 흡광도를 측정함으로써 수중의 각종 오염물질 분석에 적용한다.
흡광광도계의 구성
< 광원부 - 파장선택부 - 시료부 - 측광부 >
키워드에 대한 정보 흡광도 에 영향 을 미치는 요인
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사람들이 주제에 대해 자주 검색하는 키워드 [수질분석 32] 흡광광도법, Absorbance 의 정의
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