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실험실에서 세포주를 장기간 보관하기 위해 Cell stock solution에 세포를 풀어서 Cryovial이라는 특수 용기에 담아 액체질소(대기압에서 온도: -196도)에 보관하게 된다.
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Stock 만드는 방법 – 네이버 블로그
melan-a를 이용해서 stock 만드는 방법에 대해 소개하려고 한다. stock을 만드는 이유는. 내가 원하는 cell을 보관해 두었다가 필요할 때 쓸 수 …
Source: m.blog.naver.com
Date Published: 6/5/2021
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cell > BRIC
cell stock 만들기에 도전중입니다.. 조성을 10% FBS 10% DMSO 5% 페니실린 나머지 media 로 했는데, FBS, DMSO, 페니 … 색이 뿌옇게 되면서 열이 나더라구요요.
Source: bric.postech.ac.kr
Date Published: 4/7/2022
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cell stock 만들기
민병걸. Cell_stock.pdf ( 88.8 KB ) Download : 1137. cell stock 만들기. cell stock 만들기. PREV →, Bone-marrow derived DC, 민병걸, 2010/06/24, 773. NEXT →
Source: webbuild.knu.ac.kr
Date Published: 4/9/2022
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Bacteria Stock 원리 및 만드는 방법 – 인생의 굴레에서1
이런 데미지도 glycerol을 넣어줌으로써 예방 가능하다. Glycerol Stock 만들기. – 준비물 : 50% glycerol solution (균주 1개당 50% glycerol …
Source: dragsoseumon.tistory.com
Date Published: 10/4/2022
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실험Q&A > 실험 > BRIC
cell stock 만들기에 도전중입니다.. 조성을 10% FBS 10% DMSO 5% 페니실린 나머지 media 로 했는데, FBS, DMSO, 페니실린까지 섞었을때 색이 뿌옇게 …
Source: sci-on.net
Date Published: 1/19/2021
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200831 cell stock 풀기 – 척척석사할래요
곧 cell culture를 해야되기 때문에 cell stock부터 푸는 것을 배웠다. 이번에 사용할 cell은 MDA-MB231 cell로 malignant breast cancer이며 culture …
Source: biorestligeist.tistory.com
Date Published: 5/21/2021
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- Date Published: 2019. 10. 25.
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Cell stock 만들기에 대하여
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Stock 만드는 방법
melan-a를 이용해서 stock 만드는 방법에 대해 소개하려고 한다
stock을 만드는 이유는
내가 원하는 cell을 보관해 두었다가 필요할 때 쓸 수 있도록 하기 위함인데
보통 -196도인 액체질소통에서 동결 보존한다
melan-a란?
A line of non-tumorigenic mouse melanocytes,
그러니까 쥐로부터 얻은 멜라닌세포인 것인데
C57BL이라는 쥐 embryo(배아)의
normal epidermal melanoblasts(표피 멜라닌모세포)에서 유래한 cell line이다
melan-a가 성장하기 위해서
“tumour promoter”를 필요로 하는데
RPMI 배지를 만들 때 넣어줬던
TPA(Tetradecanoyl Phorbol Acetate)가 tumour promoter 역할을 하기 때문에
cell을 죽이지 않고 계속해서 배양하기 위해서는 배지 만들 때 TPA를 잊지말고 넣어주어야한다
나는 melan-a를 이용한 실험을 할 때 RPMI 배지를 주로 사용한다🙂
🧞♂️Protocol🧞♂️
Bacteria Stock 원리 및 만드는 방법
이번 글에서는 bacteria를 보관하는 방법 중 하나인 Stock의 개념과 원리, 만드는 방법에 대해 다루도록 하겠다.
Stock의 개념
Stock을 만들면 매우 낮은 온도(-80℃)에 보관이 가능하므로 bacteria를 매우 긴 시간동안 (수 년 이상) 보관할 수 있다.
사람으로 치면 냉동인간을 만드는 것처럼 생각하면 된다. 그런데 사람에게 냉동인간을 적용할 수 없는 이유로 세포의 손상이 있다.
Glycerol의 역할
Glyerol
냉동 인간의 경우와 마찬가지로 bacteria도 그냥 낮은온도로 바로 얼려버리면 얼음 결정에 의해 세포 벽이 손상된다. 이를 막기 위해서 cryoprotectant로 glycerol을 넣어준다. 그 결과 어는 점을 낮춰주고, supercooling, 즉 어는점 이하여도 얼지 않고 액체 상태를 유지할 수 있다. 좀 더 자세히 설명하자면 glycerol의 -OH기가 물 분자와 수소결합을 강하게 하여 물 분자끼리의 수소결합을 방해한다. 이렇게 물 분자끼리의 결합을 방해해서 얼음 결정 생성을 생성하지 못하도록 하고, 어는 점을 낮출 수 있다.
또한 얼음 결정이 생성되면 물이 얼음으로 변하면서 세포 내의 물의 양이 줄어들게 되는데, 이는 국소적으로 염 농도가 높아져 단백질의 변성을 일으킬 수 있다. 이런 데미지도 glycerol을 넣어줌으로써 예방 가능하다.
Glycerol Stock 만들기
– 준비물 : 50% glycerol solution (균주 1개당 50% glycerol 700 ㎕ 필요), stock vial, name tag (엑셀이나 워드로 만들어서 출력), stock box, TSB (Tryptic soy broth), bacteria colony (LB 배지 혹은 TSA 배지에 키운 것)
Stock 만들기 위한 vial (cryogenic vial)
1) Liquid culture 준비하기 : Bacteria colony를 TSB에서 1일간 배양한다.
2) 50% glycerol 만들기 : 100% glycerol에 증류수를 같은 양 충분히 섞어 만든다. 그리고 오토클레이브에 돌려 멸균시키고 냉장보관 해둔다.
3) Vial tube에 300 ㎕ TSB 균액, 700 ㎕ 50% glycerol 을 넣는다.
Vial tube
4) Parafilm으로 입구를 막아준다.
Name tag 붙인 vial tube
5) Name tag을 붙이고 stock box에 넣는다.
Stock box
6) Deep freezer (-80℃)에 보관한다.
참고문헌
2011.igem.org/Team:Cambridge/Protocols/Glycerol_Stocks#/Protocols/Glycerol_Stocks
200831 cell stock 풀기
곧 cell culture를 해야되기 때문에 cell stock부터 푸는 것을 배웠다.
이번에 사용할 cell은 MDA-MB231 cell로 malignant breast cancer이며 culture하기가 쉬워서 cell culture연습용으로 쓰기에 적합하다.
Stock은 P0또는 P1의 passage가 얼려진 fresh한 상태를 의미하고, P1의 stock을 풀어 P2 passage의 cell을 키우기 시작한다. 보통 P1 stock 하나로 P2 10개를 만들 수 있으며, 가지고 있는 P1 stock이 하나밖에 안남았으면 P2를 만들어서 P2를 stock으로 쓰게된다.
P1 ● ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ (stock)
↓stock 풀기
P2 ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ
이 P2로 culture와 실험을 시작하게 된다.
Culture를 시작할 땐 P2 passage의 cell을 P0라고 다시 명명해서 부르게 되고, culture를 한 번씩 진행할 때마다 P1, P2, P3….식으로 passage가 올라간다. 뭐든지 그렇지만 cell 또한 너무 오래 키우면 fresh하지 않아 상태가 아주 좋지 않기 때문에 (사람마다 다르긴 하지만) 보통 P7~P10쯤에서는 cell을 버리고 새 stock을 풀어 다시 실험을 진행한다.
P0 →culture→ P1 →culture→ P2 →culture→…→culture→ P7(새stock 풀 때가 됐음)
Cell을 키울 땐 3가지 요소가 필요하다.
1) Media(이번엔 DMEM/High glucose media 사용): cell이 자랄 때 필요한 영양분有
2) FBS 혈청(9%): Growth factor, 호르몬 등이 있어 cell이 성장할 수 있도록 신호를 보냄
3) Antibiotics(penicillin, streptomycin 등): 균 감염을 최소화시킴
1. Media를 냉장고에 꺼내서 water bath에 넣고 30분간 뎁힌다.
Water bath는 흰색 렉이 안잠길 정도로만 물을 채워넣어준다. 물은 안쪽 싱크대의 1차 D.W.를 사용한다.
2. Stock 받침대(incubator옆 서랍에 파란색 렉)을 챙기고 옆방 액체질소탱크에서 cell stock을 꺼내온 뒤 stock을 water bath에서 3분간 녹여준다.
3. 클린벤치 안에서 15ml tube에 naming을 해준 뒤 media 4ml + cell stock 전부(1ml)를 넣어주고 centrifuge (①1000rpm/3min/25도)
클린벤치 밖에 있던 물건들은 클린벤치 안에 들어가기 전에 에탄올로 한번 닦아준 뒤 클린벤치 안으로 넣어주고 cell stock은 tube에 넣기 전 미리 피펫팅해준다.
15ml tube에 media와 cell stock을 넣어준 뒤 tube의 용액 약간을 stock tube에 옮겨 피펫팅해준 뒤 다시 15ml tube에 넣어준다. 혹시 남아있을 cell을 모두 가져오기 위해 하는 듯함.
4. 100파이 plate에 naming을 해준 뒤 media 10ml를 넣어준다.
5. Centrifuge가 끝난 3을 pellet만 남도록 suction해준 뒤 plate에 넣어둔 media 1ml를 옮겨 거품이 안나도록 조심이 피펫팅 해준다. 피펫팅을 너무 빨리 하거나 모든 용액을 빨거나 뿜어내지 않게 해준다.
6. 5를 plate에 풀고 위 아래 대각선 방향으로 살살 흔들어준다. 방향을 바꿀 때마다 잠깐 멈춰주면서 살살 흔들면 된다.
7. Plate를 incubator에 넣어준다.
8. 클린벤치 정리; suction기는 에탄올로 한번 suction해주고 클린벤치 바닥과 뚜껑을 ethanol로 닦아주고 피펫 충전기에 꽂아두기
Cell을 바로 plate에 풀어버리지 않고 굳이 centrifuge에 돌려서 media를 버리고 다시 plate에 풀어주는 단계를 거치는 이유는… cell stock에는 DMSO라는 물질이 섞여있는데 DMSO는 cell에 독성이 있는 물질이라 culture할 때 없는 것이 좋아서 DMSO를 제거하기 위해 이런 과정을 거친다. DMSO는 cell이 너무 얼지 않도록 해준다고 한다.
키워드에 대한 정보 cell stock 만들기
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